Orbal氧化溝工藝中微生物種群、關(guān)鍵酶活性與污水處理效率的關(guān)系 張夢竹*，王睿，李元志 北京梅凱尼克環(huán)保科技有限公司，北京 100085；

張夢竹*，王睿，李元志

北京梅凱尼克環(huán)�？萍加邢薰�司，北京 100085；

摘要：在實際污水廠生物處理過程中，功能酶活性對于污染物的去除起著至關(guān)重要的作用。選取以Orbal氧化溝為核心工藝的實際污水處理廠為研究對象，分別分析了不同運行模式下，活性污泥中微生物種群結(jié)構(gòu)、關(guān)鍵酶活性及其與污染物去除效率之間的關(guān)系。結(jié)果表明，適當(dāng)減少外側(cè)溝道內(nèi)轉(zhuǎn)刷的開啟數(shù)量，其溝道內(nèi)溶解氧分布將發(fā)生明顯變化，沿水流方向，厭氧或缺氧段明顯加長。同時，長期運行結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)水水質(zhì)穩(wěn)定時，運行參數(shù)變化并未對整個生物處理工段內(nèi)微生物種群結(jié)構(gòu)有明顯影響。相比而言，羥胺氧化還原酶（HAO）和硝酸還原酶（NR）這兩種關(guān)鍵酶的活性對于運行參數(shù)改變的響應(yīng)更為靈敏。并且，分析也表明，HAO和NR活性與氨氮及總氮去除呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.99和0.88。

關(guān)鍵詞：污水處理廠；Orbal氧化溝；轉(zhuǎn)刷；羥胺氧化還原酶；硝酸還原酶

第一作者：張夢竹（1987-），女，中級工程師，研究方向：污水及污泥處理及資源化。E-mail：zhangmengzhu@bjmbt.net

*通訊作者，E-mail：zhangmengzhu@bjmbt.net

Key words: Wastewater treatment plant; Orbal oxidation ditch; rotation brush; Hydroxylamine oxidoreductase; Nitrate reductase 

生物脫氮在目前城市污水氮素去除過程中起著重要作用[1-3]。已有研究表明，生物脫氮效率取決于硝化反硝化功能微生物的代謝活性[4]。眾多研究已經(jīng)明確了不同反應(yīng)體系下硝化反硝化功能微生物的種群結(jié)構(gòu)特征，并據(jù)此探討了脫氮效率與這些功能微生物之間的關(guān)系[5-7]。然而，在絕大多數(shù)實際污水處理廠生物處理單元中，各個處理段（好氧、缺氧、厭氧）極少是獨立分隔的，其功能段主要是依據(jù)溶解氧含量的差異進(jìn)行區(qū)分。在這種情況下，不同功能段的微生物種群結(jié)構(gòu)并無明顯差異。這也使得在實際污水處理廠研究過程中，分析功能微生物差異進(jìn)而說明其去除效率變得較為困難。

在氮素轉(zhuǎn)化途徑中，氨單加氧酶（AMO）和羥胺氧化還原酶（HAO）是硝化反應(yīng)的限速酶[8]，硝酸鹽原酶（NR）和亞硝酸鹽還原酶（NIR）是反硝化反應(yīng)的限速酶[9-11]。理論上，分析關(guān)鍵酶活性從而解析污染物降解過程和效率是最直接且根本的。一直以來關(guān)于生物脫氮過程中關(guān)鍵酶的研究還主要集中在酶的純化和反應(yīng)機(jī)理上[12-14]。近年來，在廢水處理過程中關(guān)于酶活性的研究已經(jīng)逐漸展開。研究者們初步分析了與TN去除相關(guān)的功能酶種類[15]，并闡述了酶活性水平與運行參數(shù)變化之間的關(guān)系[16]，探討了污水處理系統(tǒng)脫氮過程中NR和NIR的特性[17]。然而，這些研究主要集中在實驗室小試規(guī)模。事實上，實際污水處理廠運行過程比實驗室小試裝置更加復(fù)雜。因此，對于實際污水處理廠關(guān)鍵酶活性與污染物去除效率之間關(guān)系的研究是非常必要的。

氧化溝是城市污水處理的三大典型工藝之一[18]，在中國，從20世紀(jì)80年代以來，氧化溝工藝一直被廣泛采用[19]。本文以Orbal氧化溝為研究對象，分別分析了兩種運行模式下的微生物種群結(jié)構(gòu)、功能微生物含量、關(guān)鍵酶活性及污染物去除效率，并對其相互關(guān)系進(jìn)行了探討。本文的目的是揭示影響實際污水處理廠污染物去除效率的內(nèi)在因素，以期為今后實際污水處理廠提標(biāo)改造提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 污水處理廠運行模式概述

本研究是在河南省某市的一實際污水處理廠進(jìn)行的，該污水廠主體采用Orbal氧化溝工藝，污水處理量為4×104·d-1。其進(jìn)水水質(zhì)如表1所示。

研究分別在兩種模式下進(jìn)行，每種模式的運行周期為一年，具體運行參數(shù)如表2所示。兩種模式的主要區(qū)別在于溝道內(nèi)轉(zhuǎn)刷開啟數(shù)量不同，模式I，外、中、內(nèi)溝道轉(zhuǎn)刷開啟數(shù)量分別為6、4、4；模式II，溝道轉(zhuǎn)刷開啟數(shù)量分別為4、4、4。每周監(jiān)測不同模式下進(jìn)出水水質(zhì)，同時監(jiān)測溝道內(nèi)溶解氧變化，測試位置如圖1所示（包括轉(zhuǎn)刷后1 m和下一個轉(zhuǎn)刷前1 m）。同時，在每年6月和12月分別采集溝道內(nèi)活性污泥樣品，用于其微生物種群、功能微生物含量及關(guān)鍵酶活性分析。

表1 兩種模式下Orbal氧化溝的進(jìn)水水質(zhì)

表2 兩種模式下Orbal氧化溝的運行參數(shù)

圖1 Orbal氧化溝轉(zhuǎn)刷設(shè)置模式及樣品采集及測試位點示意圖（模式Ⅰ：外溝道RB1、RB2、RB3及對應(yīng)位置全開，中、內(nèi)溝道RB1、RB2及對應(yīng)位置全開；模式Ⅱ：外、中、內(nèi)溝道均為RB1、RB3及對應(yīng)位置全開。◆代表采集及測試位點。）

1.2 功能微生物特征

將采集的活性污泥樣品，4度保存并運送回實驗室，定性和定量分析兩種模式下的功能微生物特征。

1.2.1 細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)分析

采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)分析兩種運行模式下的細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)。選用核酸自動提取儀（TanBead, 臺灣圓點，中國）分別提取其總DNA，并采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的提取純度。細(xì)菌通用引物F357GC/R518[20]用來擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA片段。PCR產(chǎn)物通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（DGGE）進(jìn)行分離（凝膠濃度為8%，變形梯度為30%-60%，Bio-Rad, 美國），電泳時間為16 h。隨后采用凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad, 美國）成像并分析其多樣性[20]。

切取DGGE中的優(yōu)勢條帶，置于50 μl無菌超純水中，4 °C下過夜。采用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒（Cycle Pure Kit，OMEGA，美國）純化后，委托北京博邁德科技發(fā)展有限公司采用ABI 3730XL（3730XL，ABI，美國）測序儀進(jìn)行測序。將測序所得的序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為HQ857385-HQ857407。并利用BLAST算法在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性比對，測序所得序列及比對序列采用MEGA 6.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 氨氧化細(xì)菌（AOB）和亞硝酸鹽氧化細(xì)菌（NOB）含量測定

采用基于SYBR Green I的熒光定量PCR（RT-PCR）技術(shù)，分析兩種運行模式下活性污泥中總細(xì)菌、AOB和NOB含量。RT-PCR（TaKaRa Code, TP800）反應(yīng)體系為25 μl，其組成為： 2.5 μl 10×PCR緩沖液、12.5 μl SYBR EX Taq預(yù)混液、0.25 μl 30 μm AOB引物和10 μm NOB引物、2 μl模板及標(biāo)準(zhǔn)16S rRNA拷貝；其反應(yīng)條件為：95°C 30s預(yù)變性，95°C 5s變性、65°C 30s延伸，往復(fù)45個循環(huán)。RT-PCR的引物如表3所示[21-23]。AOB和NOB以相應(yīng)典型菌株的PCR產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)，總細(xì)菌以大腸桿菌的PCR產(chǎn)物為標(biāo)準(zhǔn)，建立RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表3 定量PCR引物序列

1.3 關(guān)鍵酶活性測定

采集運行期間溝道內(nèi)的活性污泥樣品50 ml，4 °C保存并運送回實驗室，定量分析兩種模式下的關(guān)鍵酶HAO和NR活性。首先將采集的活性污泥進(jìn)行離心富集（4 °C, 15min, 12000 rpm），然后在0.01 M的磷酸鉀緩沖液（pH 7.4）中再懸浮。得到的活性污泥懸濁液通過超聲波裂解，并再次離心（4 °C, 15min, 12000 rpm）以去除固體顆粒和細(xì)胞碎片，從而得到HAO和NR粗提取物。添加不同濃度 (NH4)2SO4進(jìn)行純化[24-26]。

兩種反應(yīng)混合物（A和B）分別用于HAO和NR的檢測。反應(yīng)混合物A：5 ml酶提取液，2 ml 0.5 mM細(xì)胞色素C，0.5 ml 2 mM HAc-NaAc緩沖液（pH 5.8）和0.5 ml 1.75 mM羥胺。HAO活性以反應(yīng)混合物中羥胺的減少量表示。反應(yīng)混合物B：5 ml酶提取液，1 ml甲基紫（MV+），10 ml 10 mM磷酸鉀緩沖液（pH 7.4），10 μl 10 mM DDT以及1 mM NaNO3。NR活性以反應(yīng)混合物中NaNO3的減少量表示。一個單位的酶活性（U）定義為：每克活性污泥中，每小時轉(zhuǎn)化1 mg催化底物所需酶的量。

1.4 其他分析

進(jìn)出水的化學(xué)需氧量（COD）、氨氮（NH4+-N）和總氮（TN）采用國標(biāo)方法進(jìn)行測定[27]。溶氧（DO）和pH值采用CellOx325和SenTix 41-3分別監(jiān)測，溫度采用WTW-Multi 340i（德國）分析儀監(jiān)測。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同模式下污水處理廠運行效果

兩種運行模式下，該廠進(jìn)出水中COD、NH4+-N和TN的監(jiān)測結(jié)果如圖2所示。在模式I和模式II下，COD的平均去除率分別為94.28±2.19%和91.79±2.77%；NH4+-N的平均去除率分別為72.80±7.07%和69.36±8.45%；TN的平均去除率分別為25.50±6.83%和44.67±10.96%。同時，圖中結(jié)果也表明，除冬季外，其余季節(jié)在模式II運行條件下，COD、NH4+-N和TN的去除率均明顯高于模式I。在4月到10月期間，模式I和模式II的COD的平均去除率分別為96.08±0.87%和94.17±0.73%；NH4+-N的平均去除率分別為81.38±3.47%和80.59±1.39%，TN的平均去除率分別為31.77±5.41%和59.81±5.33%。

圖2 兩種模式下污水處理廠COD、NH4+-N 和TN的去除效率

2.2 兩種模式下不同溝道DO濃度變化特征

在兩種運行模式下，分別對Orbal氧化溝三個溝道不同位置處DO濃度進(jìn)行測定，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，DO濃度在轉(zhuǎn)刷前和轉(zhuǎn)刷后有明顯不同，特別是在外側(cè)溝道。模式I條件下，轉(zhuǎn)刷后1 m處外渠道的DO濃度為2.28±0.3 mg·L-1，在下一個轉(zhuǎn)刷前1m處外渠道的DO濃度為0.80±0.1 mg·L-1。在模式II條件下，轉(zhuǎn)刷后1 m處外渠道的DO濃度為2.03±0.4 mg·L-1，在下一個轉(zhuǎn)刷前1 m處外渠道的DO濃度為0.16±0.1 mg·L-1。

圖3 兩種模式下不同溝道轉(zhuǎn)刷前后溶解氧濃度變花

2.3 關(guān)鍵酶活性

分別在夏季和冬季，采集兩種運行模式下三個溝道內(nèi)活性污泥樣品，進(jìn)行關(guān)鍵酶HAO和NR的活性分析。結(jié)果顯示，在同一運行模式下，與中、內(nèi)溝道相比，HAO活性在外溝道中最低。相反，NR活性在外溝道中最高。并且，HAO和NR的酶活性在夏季都高于冬季。外溝道中，在模式II條件下NR活性明顯高于模式I。模式I下，夏季和冬季的NR活性分別為1.58 mg NO3-·(g MLSS·h)-1和0.80 mg NO3-·(g MLSS·h)-1；而模式II下，夏季和冬季的NR活性分別為2.27 mg NO3-·(g MLSS·h)-1和1.07 mg NO3-·(g MLSS·h)-1。內(nèi)溝道中，模式I和模式II條件下的HAO活性并無明顯區(qū)別。模式I下，夏季和冬季的HAO活性分別為2.17 mg 羥胺·(g MLSS·h)-1和1.56羥胺mg·(g MLSS·h)-1；而模式II下，夏季和冬季的HAO活性分別為2.05 mg羥胺·(g MLSS·h)-1和1.42 mg羥胺·(g MLSS·h)-1。

3 討論

理論上，活性污泥中的微生物種群會隨著污水處理運行參數(shù)的變化而發(fā)生變化。因此，微生物種群結(jié)構(gòu)變化常用來解釋運行參數(shù)調(diào)節(jié)后污水處理效果發(fā)生變化這一現(xiàn)象[28]。本研究在一實際污水處理廠展開，研究結(jié)果顯示，當(dāng)外溝道轉(zhuǎn)刷開啟數(shù)量改變后，污水廠出水中各污染物的去除效果均發(fā)生改變，尤其是TN。適當(dāng)減少外溝道轉(zhuǎn)刷開啟的數(shù)量，將有助于TN的有效去除。

對兩種運行模式下不同溝道內(nèi)關(guān)鍵限速酶HAO和NR活性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，運行參數(shù)的變化直接對關(guān)鍵酶的活性產(chǎn)生了影響，尤其是本研究中外側(cè)溝道中NR的活性。在模式II下，冬季和夏季外側(cè)溝道內(nèi)NR活性分別比模式I下提高了25%和30%。與此同時，該水廠出水中TN的去除效率也由模式I的25.50±6.83%提高到了模式II的44.67±10.96%。綜合分析關(guān)鍵限速酶HAO、NR和TN、NH4+-N去除的關(guān)系。結(jié)果表明，HAO和NR活性與NH4+-N和TN的去除均呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.99和0.88（圖4）。也就是說，改變污水廠運行參數(shù)，生物處理單位中關(guān)鍵酶活性發(fā)生了明顯變化，從而改變了污染物的去除效率。

進(jìn)一步分析兩種運行模式下外溝道DO濃度分布特征，發(fā)現(xiàn)減少轉(zhuǎn)刷開啟數(shù)量后，Orbal氧化溝外側(cè)溝道內(nèi)缺氧或厭氧區(qū)段有所增加。這主要是由于減少外側(cè)溝道的轉(zhuǎn)刷數(shù)量，也就減少了供氧量，從而改變了外側(cè)溝道的局部微環(huán)境條件。趙群英等學(xué)者的研究也發(fā)現(xiàn)，DO含量的變化對污水出水水質(zhì)具有明顯影響[34]。而這種微環(huán)境條件的改變，在不影響其微生物種群結(jié)構(gòu)的情況下，直接提升了溝道內(nèi)關(guān)鍵酶活性，進(jìn)而提升了污水出水水質(zhì)。

也就是說，在實際污水處理廠中，改變運行參數(shù)后，相對于微生物種群結(jié)構(gòu)和功能微生物含量而言，關(guān)鍵酶活性的響應(yīng)更為快速靈敏。因此，這一研究結(jié)果對于現(xiàn)行污水處理廠提標(biāo)改造是具有非常重要的實際參考依據(jù)的。

然而，本研究所采用關(guān)鍵酶活性分析僅僅是酶粗提取物的分析，并且僅在一座污水處理廠進(jìn)行。如要將該方法進(jìn)一步用于解析實際污水處理廠運行參數(shù)變化對處理效果影響原因時，接下來需要更為精準(zhǔn)且廣泛的研究。例如，結(jié)合更多實際污水處理廠的研究，綜合分析多種運行參數(shù)變化后其關(guān)鍵酶的響應(yīng)過程；同時，設(shè)計小型批量研究實驗，對提取的關(guān)鍵酶進(jìn)行純化，進(jìn)而分析不同運行參數(shù)條件下關(guān)鍵酶的響應(yīng)關(guān)系。

圖4 HAO、NR活性與NH4+-N, TN去除率之間的相關(guān)關(guān)系

4 結(jié)論

通過實際污水處理廠運行參數(shù)的改變，可有效提高污水中污染物的去除效率。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在實際污水處理廠中，運行參數(shù)改變后，其生物反應(yīng)體系中局部環(huán)境（例如溶解氧）會及時響應(yīng)。在此過程中，微生物種群結(jié)構(gòu)在一定程度上仍然保持穩(wěn)定，并未發(fā)生明顯變化。但是其中關(guān)鍵酶的活性會隨著局部環(huán)境條件的變化而即時發(fā)生響應(yīng)，從而改善污染物的去除效率。因此，可將關(guān)鍵酶活性變化作為未來污水處理廠提標(biāo)改造研究過程中重要的參考依據(jù)之一。

參考文獻(xiàn)：

[1] AHN J H，KWAN T，CHANDRAN K. Comparison of partial and full nitrification processes applied for treating high-strength nitrogen wastewaters: microbial ecology through nitrous oxide production [J]. Environmental Science & Technology，2011，45 (7)：2734-2740.

[2] 楊瑞麗，王曉君，吳俊斌，等. 厭氧氨氧化工藝快速啟動策略及其微生物特性 [J]. 環(huán)境工程學(xué)報，2018，12（12）：3341-3350. 

[3] SHN D T，HE Y L，YUE H，et al. Microbial structures and community functions of anaerobic sludge in six full-scale wastewater treatment plants as revealed by 454 high-throughput pyrosequencing [J]. Bioresource Technology，2015，186：163-172.

[4] KIM Y M，CHO H U，LEE D S，et al. Influence of operational parameters on nitrogen removal efficiency and microbial communities in a full scale activated sludge process [J]. Water Research，2011，45：5785-5795.

[5] KRISHNA MOHAN T V，NANCHARAIAH Y V，VENUGOPALAN V P，et al. Effect of C/N ratio on denitrification of high-strength nitrate wastewater in anoxic granular sludge sequencing batch reactors [J]. Ecological Engineering，2016，91：441-448.

[6] ZHOU S，SUN Y，ZHANG Y，et al. Variations in microbial community during nitrogen removal by in situ oxygen-enhanced indigenous nitrogen-removal bacteria [J]. Water Science and Engineering， 2018，11(4)：276-287.

[7] WANG D，LI T，HUANG K， et al. Roles and correlations of functional bacteria and genes in the start-up of simultaneous anammox and denitrification system for enhanced nitrogen removal [J]. Science of the Total Environment，2019，655：1355–1363.

[8] GATES A J, RICHARDSON D J, BUTT J N. Voltammetric characterization of the aerobic energy-dissipating nitrate reductase of Paracoccus pantotrophus: exploring the activity of a redox-balancing enzyme as a function of electrochemical potential [J]. Biochemical Journal，2008，409：159-168.

[9] FOURMOND V，BURLAT B，DEMENTIN S，et al. Dependence of catalytic activity on driving force in solution assays and protein film voltammetry: insights from the comparison of nitrate reductase mutants [J]. Biochemistry，2010，49：2424-2432.

[10] PANG J，MATSUDA M，KURODA M，et al. Characterization of the genes involved in nitrogen cycling in wastewater treatment plants using DNA microarray and most probable number-PCR [J]. Frontiers of Environmental Science & Engineering，2016，10(4)： 7.

[11] HOPPERT M，MAHONY T J，MAYER F，et al. Quaternary structure of the hydroxylamine oxidoreductase from Nitrosomonas europaea [J]. Archives of Microbiology，1995，163：300-306.

[12] LI M，LIANG Z，CALLIER M D，et al. Nitrogen and organic matter removal and enzyme activities in constructed wetlands operated under different hydraulic operating regimes [J]. Aquaculture，2018，,496：247–254.

[13] LI B，YAN W，WANG Y，et al. Effects of key enzyme activities and microbial communities in a flocculentgranular hybrid complete autotrophic nitrogen removal over nitrite reactor under mainstream conditions [J]. Bioresource Technology，2019，280：136-142.

[14] NAJMUDIN S，GONZALEZ P J，TRINCO J，et al. Periplasmic nitrate reductase revisited: a sulfur atom completes the sixth coordination of the catalytic molybdenum [J]. Journal of Biological Inorganic Chemistry，2008，13：737-753.

[15] LI Y H，LI H B，WANG X，et al. Changes in microbial populations and enzyme activities during nitrogen biodegradation of domestic sewage treatment in the subsurface wastewater infiltration system [J]. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology，2011，87：431-435.

[16] CALDERON K，GONZALEZ -MARTINEZ A，MONTERO-PUENTE C，et al. Bacterial community structure and enzyme activities in a membrane bioreactor (MBR) using pure oxygen as an aeration source [J]. Bioresource Technology，2012，103：87-94.

[17] PAN J，YU L，LI G Z，et al. Characteristics of microbial populations and enzyme activities in non-shunt and shunt subsurface wastewater infiltration systems during nitrogen removal [J]. Ecological Engineering，2013，61：127-132.

[18] 張揚，陳豪，宋英豪，等. Orbal 氧化溝的應(yīng)用及發(fā)展趨勢[J]. 環(huán)境工程，2009，27（4）：62-64.

[19] 張小燕，王剛，郭華，等. Orbal 氧化溝+深度處理在城鎮(zhèn)污水處理廠中的應(yīng)用[J]. 中國給水排水，2017，33（4）：56-58. 

[20] HAN Y，LIU J，GUO X，et al. Micro-environment characteristics and microbial communities in activated sludge flocs of different particle size [J]. Bioresource Technology，2012，124：252-258.

[21] HARMS G，LAYTON A C，DIONISI H M，et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant [J]. Environmental Science & Technology，2003，37：343-351.

[22] LIMPIYAKORN T，SHINOHARA Y，KURISU F，et al. Communities of ammonia -oxidizing bacteria in activated sludge of various sewage treatment plants in Tokyo [J]. FEMS Microbiology Ecology，2005，54：205-217.

[23] ZHAO B，HE Y L，HUGHES J，et al. Heterotrophic nitrogen removal by a newly isolated Acinetobacter calcoaceticus HNR [J]. Bioresource Technology，2010，101：5194-5200.

[24] ZHANG S M，LI W G，ZHANG D Y，et al. Purification and Characterization of a Low-temperature Hydroxylamine Oxidase from Heterotrophic Nitrifier Acinetobacter sp. Y16* [J]. Biomedical and Environmental Sciences，2014，27(7)：515-522.

[25] SINGH D K，KUMAR S. Nitrate reductase, arginine deaminase, urease and dehydrogenase activities in natural soil (ridges with forest) and in cotton soil after acetamiprid treatments [J]. Chemosphere，2008，71：412-418.

[26] SACHDEVA V，HOODA V. Effect of changing the nanoscale environment on activity and stability of nitrate reductase [J]. Enzyme and Microbial Technology，2016，89：52-62.

[27] CEPB (China Environmental Protection Bureau). Standard Methods for Examination of Water and Wastewater，4th ed. Chinese Environmental Science Press，China. 2004.

[28] GRAHAM D W，SMITH V H. Designed ecosystem services: application of ecological principles in wastewater treatment engineering [J]. Frontiers in Ecology and the Environment，2004，2：199-206.