介紹

2003年嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(SARS)在全世界造成了8000多例病例產(chǎn)生，死亡率約為10%(Manocha et al. 2003;Centers for Disease Control 2004)。最后已知的爆發(fā)是在2004年北京的一個(gè)研究實(shí)驗(yàn)室。這種疾病的原因被確定為一種新的人類冠狀病毒，很可能起源于麝貓，潛在宿主可能是蝙蝠(Guan et al. 2003; Lau et al. 2005; Wanget al. 2006)。冠狀病毒是有包膜的單鏈RNA病毒，大小從60～220納米不等。它們可以感染鳥類和哺乳動(dòng)物，包括人類，并通過氣溶膠或糞便-口腔途徑傳播。冠狀病毒在爆發(fā)期間的迅速傳播表明，人類冠狀病毒的主要傳播方式是呼吸道飛沫；然而，沒有直接證據(jù)支持這一點(diǎn)(Belshe 1984)。由于迄今為止人類冠狀病毒感染被認(rèn)為是一種溫和的、自我限制的疾病，因此關(guān)于其在環(huán)境中的傳播潛力的信息有限。

鑒于2003年3月在香港高層住宅區(qū)爆發(fā)的涉及300多人的SARS疫情與一個(gè)有缺陷的污水系統(tǒng)有關(guān)(Peiris et al.2003)，SARS疫情傳播可能與水和廢水有關(guān)。SARS-CoV可在腸道內(nèi)復(fù)制 (Leung et al. 2003)，這一事實(shí)使其成為一種可能的腸道病原體，而SARS病例中腹瀉的發(fā)生率在8%～73%之間(SARS流行病學(xué)工作組，2003)，這引起了人們對(duì)其潛在環(huán)境傳播的關(guān)注。Leung等人(2003)還報(bào)道，從SARS患者小腸中獲得的病毒培養(yǎng)物產(chǎn)量高于作為該病毒靶器官的肺組織。傳染性病毒是從SARS患者感染后3周內(nèi)的糞便中分離出來的(Chan et al. 2004; Liu et al. 2004)。SARS的出現(xiàn)及其傳播問題表明需要更多的信息，特別是冠狀病毒在水和廢水中的存活情況。本研究比較了代表性冠狀病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒1型在自來水和廢水中的存活情況。02

材料和方法

貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV) (ATCC-990)：一種貓科動(dòng)物的腸道冠狀病毒，在克蘭德爾里瑟貓腎細(xì)胞系(CRFK) (ATCC-94)中繁殖和檢測。人冠狀病毒229E (HCoV) (ATCC-740)：一種呼吸道病毒，在胎兒肺成纖維細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞系(ATCC-171)中繁殖和分析。脊髓灰質(zhì)炎病毒1 LSc-2ab (PV-1)：一種已知的在環(huán)境中非常穩(wěn)定的人類腸道病毒，在布法羅綠猴腎(BGM)細(xì)胞系中繁殖和檢測。在單層細(xì)胞中觀察到細(xì)胞致病作用(CPE)后，將感染細(xì)胞在-20℃冷凍和解凍三次以釋放病毒。隨后在1000g離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片，加入到9%聚乙二醇(相對(duì)分子質(zhì)量8000)和0.5 M氯化鈉的病毒懸浮液中，并在4℃下攪拌過夜。在10000g離心30分鐘后，用0.01 M磷酸鹽緩沖鹽水(PBS; pH 7.4)(Sigma, St. Louis, MO)重懸至原始病毒懸液體積的5%。然后將冠狀病毒進(jìn)行效價(jià)測定并儲(chǔ)存在-80℃下。脊髓灰質(zhì)炎病毒通過用等體積的Vertrel XF (Dupont, Wilmington，DE)提取進(jìn)一步純化，乳化后以7500g離心15分鐘，隨后收集頂層水層，進(jìn)行效價(jià)測定并在-80℃儲(chǔ)存。

自來水樣本是從實(shí)驗(yàn)室的冷水龍頭中采集的。水源是地下水，水質(zhì)參數(shù): pH 7.8，溶解固體297mg/L，總有機(jī)碳0.1mg/L。在收集樣品之前，讓水流動(dòng)3分鐘。在未過濾的自來水和通過0.2μm孔徑過濾器去除細(xì)菌的自來水中測定病毒存活率。將自來水(30mL)加入到無菌的50mL聚丙烯離心管中，以減少附著在容器上的病毒損失。添加無菌硫代硫酸鈉至最終濃度33μg/mL，以使水脫氯。渦旋后，將病毒添加到每個(gè)管中，最終濃度為105TCID50/mL。再次渦旋離心管并立即取樣(零時(shí)間點(diǎn))。然后將離心管儲(chǔ)存在4℃或室溫下(23℃)。室溫下儲(chǔ)存的離心管用鋁箔覆蓋，以防暴露在光線下。在1、3、6、10、15和21天后對(duì)離心管取樣，并將樣品在-80℃下冷凍，直到它們在細(xì)胞上被分析。初級(jí)出水和剩余活性污泥(二級(jí))的樣品來自于美國亞利桑那州圖森市羅杰路污水處理廠，并收集在無菌聚丙烯瓶中。沉淀后收集初級(jí)出水，氯化前收集二級(jí)出水。該設(shè)施一級(jí)出水的典型水質(zhì)參數(shù)為生物需氧量(BOD)和1懸浮固體(10～220mg/L)。通常相比初級(jí)出水，二級(jí)出水中的BOD和懸浮固體減少了90%～95%。將出水(30mL)加入到無菌的50mL聚丙烯離心管中。在添加病毒之前，一級(jí)出水通過0.2μm孔徑的過濾器過濾，并且未經(jīng)過濾的也進(jìn)行測試。二級(jí)出水僅未經(jīng)過濾的進(jìn)行測試。然后將病毒添加到每個(gè)離心管中，最終濃度為105TCID50/mL。將離心管渦旋，立即取樣(零時(shí)間點(diǎn))。然后將離心管覆蓋并保持在室溫(23℃)。在1、2、3、6、10、15和21天后收集樣品，并將樣品在-80℃下冷凍直至分析。使用噬斑試驗(yàn)或TCID50技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)物上計(jì)數(shù)病毒。在6孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板中，通過噬斑測定法(Payment and Trudel 1993)測定了PV-1的效價(jià)。這是一種直接定量方法，最低檢測限為10 pfu/mL。將每種稀釋液接種在兩個(gè)孔中。在細(xì)胞培養(yǎng)中不形成斑塊的冠狀病毒，通過組織培養(yǎng)感染劑量50%技術(shù)(TCID50)在24孔塑料細(xì)胞培養(yǎng)板中測定其效價(jià)(Payment and Trudel 1993)。這種技術(shù)確定了顯示出CPE的50%的原液的稀釋度。取稀釋倍數(shù)的反對(duì)數(shù)，得到每毫升TCID50的病毒效價(jià)。該方法的最低檢測值為每毫升3.7個(gè)病毒。將每種稀釋液接種在至少8個(gè)孔中。在添加病毒之前，任何來自測試水的樣品都必須在細(xì)胞培養(yǎng)檢測之前過濾，以消除細(xì)菌污染。在pH為7下使3%牛肉提取物(Becton Dick-inson，Sparks，MD)通過以阻斷可能吸附病毒的位點(diǎn)來制備具有聚醚砜(PES)膜的0.2 μm低蛋白結(jié)合Millex過濾器(Millipore, Billerica, MA)。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。03

結(jié)果和討論

表1顯示了三種病毒在測試水中的存活天數(shù)。每種病毒的對(duì)數(shù)減少量由公式“lgN/N0”計(jì)算，其中N是指定日期的病毒效價(jià)，N0是時(shí)間為0的病毒效價(jià)。線性回歸的斜率用于確定存活率；病毒效價(jià)下降99%和99.9%所需的時(shí)間(分別表示為T99和T99.9)。

影響病毒在水中存活的因素包括溫度、有機(jī)物和好氧微生物(John and Rose 2005; Melnick and Gerba 1980; Sobseyand Meschke 2003)。對(duì)病毒存活最關(guān)鍵的影響因素就是溫度。已有研究表明，病毒存活率隨著溫度的升高而降低，這主要是由蛋白質(zhì)變性和胞外酶活性增加引起的(Hurst et al. 1980; John and Rose2005)。自來水研究的結(jié)果證實(shí)冠狀病毒就是這種情況。通過測試過濾后的自來水，我們減少或消除了顆粒有機(jī)物和細(xì)菌的影響。在室溫下，只需要10天就能使過濾后的自來水中的冠狀病毒減少99.9%，而在4℃時(shí)，這種程度的病毒滅活則需要100天以上。PV-1在自來水中4℃的存活與冠狀病毒相似，但在室溫(23℃)下，該病毒在過濾水和未過濾水中的存活時(shí)間都延長了六倍。圖1和圖2分別顯示了三種研究病毒在室溫(23℃)和4℃下在自來水中的存活情況。隨著時(shí)間的推移，病毒效價(jià)從4℃水中的初始效價(jià)上升，這可能是由于病毒傾向于形成聚集物然后分解，而不是由于病毒在樣本中的復(fù)制。

圖1室溫（23℃）條件下三種病毒在脫氯、過濾后自來水中的對(duì)數(shù)減少量

圖2 4℃條件下三種病毒在脫氯、過濾后自來水中的對(duì)數(shù)減少量（*代表未過濾）

水中有機(jī)物和懸浮固體的存在可以為吸附在這些顆粒上的病毒提供保護(hù)，但同時(shí)如果這些固體沉淀下來，也可以成為去除病毒的一種機(jī)制。從自來水到二級(jí)出水再到一級(jí)出水，測試水中的有機(jī)物和懸浮固體含量都有所增加。過濾后的自來水比未過濾的自來水對(duì)冠狀病毒滅活作用更強(qiáng)。此外，HCoV在未過濾的一級(jí)出水中的存活時(shí)間比過濾后的長。這表明較高的固體含量確實(shí)為水中的冠狀病毒提供了保護(hù)。然而，對(duì)PV-1來說，過濾對(duì)其在自來水中的存活影響很小。在一級(jí)出水中，經(jīng)過濾出水中的PV-1存活時(shí)間是未經(jīng)過濾出水中的三倍。值得注意的是，在添加到廢水中的時(shí)間和立即回收用于測試的時(shí)間(零時(shí)間點(diǎn))之間，冠狀病毒的效價(jià)顯著降低。加入廢水后，冠狀病毒的效價(jià)立即下降了99.9%，而PV-1效價(jià)僅下降了10%。這種減少可能是由于廢水中溶劑和洗滌劑的存在，它們會(huì)破壞病毒包膜并最終使病毒失活。這也可能表明冠狀病毒比PV-1更容易吸附廢水中的固體。病毒包膜的疏水性使得冠狀病毒在水中的溶解性降低，因此增加了這些病毒粘附在固體上的可能性。廢水樣本必須經(jīng)過過濾，以防止細(xì)菌污染細(xì)胞單層，這將去除顆粒物和任何與之相關(guān)的病毒。捕食性微生物如原生動(dòng)物的存在可以增加水中病毒的失活率，蛋白酶和核酸酶也有這種作用(Gerba et al.1978; John and Rose 2005)。與二級(jí)出水相比，初級(jí)出水的細(xì)菌和固體含量都較高。所有三種測試病毒在未過濾的初級(jí)出水中的存活時(shí)間都比未過濾的二級(jí)出水長，盡管對(duì)FIPV來說這是可以忽略的。這再次表明，廢水中的顆粒物相關(guān)病毒受到保護(hù)，不會(huì)被捕食和滅活。然而，冠狀病毒在3天后低于最低檢測限，而PV-1在21天后仍可檢測到。廢水中研究病毒的平均對(duì)數(shù)減少結(jié)果列于表2。

結(jié)論

這項(xiàng)研究的結(jié)果表明，冠狀病毒比PV-1對(duì)溫度更敏感，并且PV-1和冠狀病毒在廢水中的存活性有相當(dāng)大的差異。其部分可能原因是包膜病毒在環(huán)境中不如非包膜病毒穩(wěn)定。冠狀病毒在廢水中很快死亡，在2～3天內(nèi)減少了99.9%，這與SARS-CoV存活數(shù)據(jù)相當(dāng)(Wang et al. 2005a, b)。冠狀病毒在初級(jí)出水中的存活時(shí)間僅略長于二級(jí)出水，這可能是因?yàn)閼腋」腆w含量較高，可以防止其失活。PV-1比冠狀病毒存活時(shí)間長得多，初級(jí)出水需要10天，二級(jí)出水需要5天，才能達(dá)到與冠狀病毒相當(dāng)?shù)臏缁盥�。本研究表明，冠狀病毒在水環(huán)境中的傳播要比腸道病毒少，因?yàn)樵诃h(huán)境溫度下，冠狀病毒在水中和廢水中會(huì)更快地失活。

原標(biāo)題:冠狀病毒在水和廢水中的存活